一九零三年，摩尔根被聘任为哥伦比亚大学实验动物学教授，开始进化和遗传方面的研究工作，他对孟德尔豌豆实验得出遗传因子分离定律、自由组合定律将信将疑，想通过动物实验进行证实。
因为之前摩尔根从事胚胎学研究，对老鼠比较熟悉，实验前几年，他和学生使用家鼠和野鼠杂交进行实验研究，可能是老鼠繁殖周期太长，繁殖效率太低，实验进行几年没有取得进展。
一九零八年，摩尔根开始使用果蝇作为实验材料。
果蝇饲养容易，一点点香蕉浆就可以当它们一天的口粮；果蝇繁殖力强，条件适宜的情况下，一天时间卵即可孵化出幼虫，两三天变成蛹，再过五天变为成虫，一年可以繁殖三十代以上；果蝇体形小，一只牛奶瓶就可以饲养几十只。
想要研究遗传，必须让实验动物有可以区分的特征，这些特征只能通过变异获得，经过两年漫长的实验，摩尔根终于获得一只变异的白眼雄果蝇，以前的培育出的果蝇都是红眼，白眼是第一次出现。
摩尔根激动万分，将这只宝贝果蝇放在单独的瓶子中饲养。每天晚上，摩尔根带着这只果蝇回家，睡觉时将实验瓶放在身边，白天又带着它去上班，生怕它出现意外情况。
在他的精心照料下，原本虚弱的白眼果蝇终于在与一只红眼雌性果蝇交配后才寿终正寝，将突变的基因留给了下一代果蝇，留给了苦心栽培它的摩尔根。
这只白眼雄果蝇的后代，十天后长大为果蝇成虫，全部都是红眼。
根据孟德尔的遗传理论推断，红眼是显性基因，白眼是隐性基因，只有只有染色体上对应的两个基因都是白眼基因，果蝇才会显现出白眼特征。
他用这些变异白眼雄果蝇基因的后代互相交配，产生第二代杂交果蝇。焦急地等待了十天，摩尔根得到了第二代杂交果蝇，其中有三千四百七十个红眼果蝇，七百八十二个白眼果蝇，大致符合四分之一的比例，证实了孟德尔的遗传定律。
后来，他让一只白眼雌果蝇与一只正常的雄果蝇交配，却在其后代中得到雄果蝇全部是白眼，而雌果蝇中却没有白眼，全部雌性都长有正常的红眼睛。
由此摩尔根提出一种假说，果蝇眼睛的颜色基因与性别决定的基因是结合在一起的，即在X染色体上，或者就是两种基因有某种连锁效应，假如一条带有白眼基因的X染色体，又有一条有白眼基因的Y染色体，即发育为白眼雄果蝇。
后续他们又观察到果蝇多次变异特征，进行遗传学实验，都表现出相同的规律。
根据一系列的实验结论，一九一一年，摩尔根提出了“染色体遗传理论”。
摩尔根发现，代表生物遗传秘密的基因的确存在于生殖细胞的染色体上，并且，基因在每条染色体上是直线排列的。到一九二五年的时候，摩尔根已经发现果蝇有四对染色体，并鉴定出约一百个不同的基因。
染色体可以自由组合，而排在一条染色体上的基因是不能自由组合的。摩尔根把这种特点称为基因的“连锁”。
他在长期的试验中发现，由于同源染色体的断离与结合，而产生了基因的自由组合。不过这种基因交换的情况很少，只占百分之一。
基因的连锁和互换是生物界的普遍现象，也是造成生物多样性的重要原因之一。
基因的连锁和交换定律，是摩尔根发现的遗传第三定律。
这条定律是摩尔根在遗传学领域的一大贡献，与孟德尔提出的基因分离定律、自由组合定律一道，被称为遗传学三大定律。
摩尔根由此创立了着名的基因学说，揭示了基因是组成染色体的遗传单位，它能控制遗传性状的发育，也是突变、重组、交换的基本单位。继孟德尔的豌豆实验后，摩尔根的果蝇实验，将生物遗传学研究又向前推进了一大步。
一九二八年，六十二岁的摩尔根受聘担任加州理工学院生物学部主任，将在哥伦比亚大学工作时的同事布里奇斯、斯图蒂文特和杜布赞斯基等人再次组织在一起，重建了一个遗传学研究中心，继续从事遗传学及发育，分化问题的研究。
一九三三年，诺贝尔诞辰一百周年之际，摩尔根由于对遗传的染色体理论的贡献而被授予了诺贝尔生理学或医学奖。
摩尔根并没有到瑞典去出席颁奖仪式，借口是自己工作太忙，主要还是他本人不喜欢一本正经地在公众集会出现，除了科学讨论会，他对于政治和其他集会均不感兴趣。
这点倒是很合曾凡的胃口，因为他也是这样的人，好像科研人员中这样的人很多。
一九四一年，摩尔根以七十五岁高龄宣布退休，离开了实验室，四年后，摩尔根因病去世。
人们对他最好的纪念，也许要算将果蝇染色体图中基因之间的单位距离叫做“摩尔根”，他的名字作为基因研究的一个单位而长存于世。
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