刘秀让他试试，马援披甲持兵，飞身上马，手扶马鞍，四方顾盼，一时须发飘飘，神采飞扬，真可谓烈士暮年，老当益壮。刘秀见马援豪气不除，雄心未已，很受感动，笑道：“这个老头好健康啊！”于是派马援率领中郎将马武、耿舒、刘匡、孙永等人率四万人远征武陵。
出征前，亲友来给马援送行。马援对老友谒者杜愔说：“我受国家厚恩，年龄紧迫余日已经不多，时常以不能死于国事而恐惧，现在获得出征机会，死了也心甘瞑目，害怕的是一些长者家儿或在左右，或参与后事，特别难以调遣，我独为此耿耿于心啊。”
建武二十五年（49年），马援率部到达临乡，蛮兵来攻，马援迎击，大败蛮兵，斩俘两千余人，蛮兵逃入竹林中。此前，当部队到下隽时，有两条路可走，一是经壶头山，一是经充县。经壶头山，路近，但山高水险，经充县，路远，粮运不便，但道途平坦。究竟该从哪儿进发，刘秀开始也拿不定主意。耿舒，就是马援在出发时说的那些权贵子弟中的一个，想从充县出发，而马援则认为，进军充县，耗日费粮，不如直进壶头，扼其咽喉，充县的蛮兵定会不攻自破。两个人意见不一致，便上表说明情况，请皇帝裁决，皇帝同意马援的意见。
三月，马援率军进驻壶头。蛮兵据高凭险，紧守关隘。水势湍急，汉军船只难以前进。加上天气酷热难当，好多士兵得了暑疫等传染病而死。马援也身患重病，部队陷入困境。马援命令靠河岸山边凿成窟室，以避炎热的暑气。虽困难重重，但马援意气自如，壮心不减。每当敌人登上高山、鼓噪示威，马援都拖着重病之躯出来观察了望敌情。手下将士深为其精神所感动，不少人热泪横流。
但耿舒却在此时写信给其兄好畤侯耿弇，告了马援一状：“前次我上书建议当先进攻充县，粮虽难运而兵马得以展开使用，军人数万争先奋进。今困在壶头不得进，大众忧郁将死，实可痛惜。前次到临乡，贼无故自己到来，当时如果乘夜攻击，就可消灭掉。伏波用兵像西域的贾胡，到一处后就止步不前，因此失利。今果然困于疾疫，都如我所预言的一样。”
耿弇收到此信，当即奏知刘秀。刘秀就派虎贲中郎将梁松去责问马援，并命他代监马援的部队。梁松到时，马援已死。梁松旧恨难消，乘机诬陷马援。刘秀大怒，追收马援新息侯印绶。
梁松对马援素有怨恨，原因比较复杂。一是马援写信告诫晚辈，梁松曾受到牵累。
马援当年南征交趾，在前线听说侄儿马严、马敦到处乱发议论，讥刺别人，而且跟一些轻狂不羁的人物结交往来，便立即写信劝诫他们。信中举杜季良之例。杜季良当时正任越骑司马，他的仇人以马援此信为据，上奏章控告他，说他：“行为轻薄，乱群惑众，伏波将军从万里外写信回来以他训诫兄子，而梁松、窦固与之交往，将煽动轻佻虚伪，败乱我中华。”
刘秀览此奏章，把窦固、梁松召来严加责备，并且把奏章和马援的信给他们看。二人叩头流血，才免去罪过。结果杜季良被罢官，龙伯高则被升任零陵太守。
当初南征交趾时，马援常吃一种叫薏苡的植物果实。这薏苡能治疗筋骨风湿，避除邪风瘴气。由于当地的薏苡果实硕大，马援班师回京时，就拉了满满一车，准备用来做种子。当时人见马援拉了一车东西，以为肯定是南方出产的珍贵稀有之物。于是权贵们都希望能分一点，分不到便纷纷议论，说马援的坏话。但马援那时正受刘秀宠信，所以没人敢跟皇帝说。马援死后，有人上书说马援曾搜刮了一车珍珠文犀运回。马武、侯昱等人也上表章，说马援确曾运回过一车珍稀之物。刘秀更加愤怒。
马援的家人不知皇帝为何如此震怒，不知马援究竟身犯何罪，惶惧不安。马援的尸体运回，不敢埋和原来的坟地，只买了城西几亩地，草草埋葬在那里。马援的宾朋故旧，也不敢到马家去吊唁，景况十分凄凉。葬完马援后，马援的侄儿马严和马援的妻子儿女们到朝廷请罪。刘秀拿出梁松的奏章给他们看，马援夫人知道事情原委后，先后六次向皇帝上书，申诉冤情，言辞凄切。刘秀这才命令安葬马援。前任云阳令朱勃也上书为马援鸣不平。
永平三年（60年），马援的女儿被立为皇后。汉明帝在云台图画建武年间的名臣列将，为了避椒房之嫌，单单没画马援。东平王刘苍观看图像时，问明帝道：“为什么不画伏波将军的像呢？”明帝笑而未答。
直至永平十七年（74年），马援夫人去世，朝廷才为马援聚土为坟，植树为标记，建筑祠堂。
建初二年（78年），汉章帝派五官中郎将持节追加策封，追谥马援为“忠成”。
马英九的祖先, 生前为祖国统一鞠躬尽瘁, 死后成为守护湘西的神只
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