康熙三年九月二十六日，清廷“会审汤若望，以及钦天监官员，翌年三月十六日，廷议将钦天监监正汤若望，刻漏科杜如预，五官挈壶正杨弘量，历科李祖白，春官正宋可成，秋官正宋发，冬官正朱光显，中官正刘有泰等皆凌迟处死。已故刘有庆子刘必远，贾良琦子贾文郁，宋可成子宋哲，李祖白子李实，汤若望义子潘尽孝俱斩立决。”
在汤若望等人经初审被判处死刑之后，曾进行了一次由中国、回回和西洋三种观测法同时预测日食时间的实际检验活动。结果南怀仁等人据西洋历法预测的日食时间与事实相符，最为正确。但是，对汤若望等人的处罚非但没有减轻，反而又加重了：由绞刑变成了最残酷的凌迟。事情很清楚，朝廷只是希望南怀仁等人出现错误，从而为迫害他们寻找有力的借口。否则的话，西洋人正确的日食预报应该成为减轻或撤销他们罪名的理由和依据。
按照判决，次年汤若望应凌迟处死。但不久天上出现被古人认为不祥之兆的彗星。京城又突然发生了大地震，皇宫在地震中遭到破坏，而且有宫殿着火。这显然吓呆了清宫统治者。汤若望免死羁狱，旋获孝庄太皇太后特旨释放，汤的仆人潘尽孝也免去一死。而其他上面列出的从事西学的汉人，还是被斩头。至此，徐光启在崇祯年间，精心培养的一大批汉人的西方数学天文专家，被彻底杀灭扫荡干净。
康熙五年七月十五(1666年8月15日)，汤若望病死于寓所。 康熙八年，康熙给汤若望平反。1669年十一月十六日，康熙又发布了对汤若望的祭文：“皇帝谕祭原任通政使司通政使，加二级又加一级，掌钦天监印务事，故汤若望之灵曰：鞠躬尽瘁，臣子之芳踪。恤死报勤，国家之盛典。尔汤若望，来自西域，晓习天文，特畀象历之司，爰锡通微教师之号。遽尔长逝，朕用悼焉。特加因恤，遣官致祭。呜呼，聿垂不朽之荣，庶享匪躬之报。尔有所知，尚克歆享。”?
汤若望在顺治年间所受的恩宠与隆遇使得天主教当时在中国的传播较为顺利。随着传教士人数的增加，活动范围的扩大、信徒在不断发展。在汤若望时代，教堂在中国已有30多处，据德礼贤先生统计1650年信徒人数就已达到人。
顺治皇帝的去世，使汤若望失去了宫廷保护人，他的命运也发生了巨大的转折。
虽然关外的爱新觉罗氏家族直入北京，统一中国，但具有几千年历史的儒家思想仍然是当时中国传统文化的主流，孔孟之道根深叶茂。早在顺治时期，就有一些汉族士大夫反对顺治信任汤若望等传教士，对汤若望竟然在中国发展了十几万天主教徒极其不满，极力主张从葡萄牙人手里收回澳门。安徽歙县的官生杨光先就是他们的代表，他首先向西方传教士发难。杨光先对天主教早有所闻，于顺治十五年在京城看到被钉死于十字架上的耶稣受难画像之后，才确认天主教就是耶稣教，从此即有“弹劾”汤若望的念头。顺治十六年至十七年之间，杨光先撰写了《辟邪论》上、中，下三篇以及《摘谬十论》、《正国体呈》、《中星说》、《选择议》等多篇文章，又多次亲自来到礼部，通政使司等衙门状告汤若望。杨光先指出，天由二气结撰而成，并非天主所造。耶稣是彼国谋叛的罪魁，因事败露而被正法，绝非造天圣人。所谓天主耶稣于汉元寿二年降生之说，纯属荒唐怪诞。“若耶稣即是天主，则汉哀以前尽是无主之世界”。“设天果有天主，则覆载之内四海万国，无一而非天主之所宰制，必无独主如德亚一国之理。独主一国，岂得称天主哉”。他进而又说，汤若望等“非我族类，其心必殊”，倘若天下之人，“只爱其器具之精工，而忽其私越之干禁”，则无异于“爱虎豹之文皮，而豢之卧榻之内，忘其能噬人矣”。同时，又斥责汤若望在《时宪历书》封面上题写“依西洋新法”五个字，其目的是“借大清之历以张大其西洋，而使天下万国晓然知大清奉西洋之正朔”。说汤若望借西洋新法阴行邪教，而“谋夺人国是其天性，今呼朋引类，外集广澳，内官帝掖，不可无蜂虿之防”。因为当时顺治帝尚在，汤若望仍受朝廷器重，而礼部又不理睬杨光先的状告，所以汤若望等人对杨光先的反教举动未加重视。
康熙初，汤若望等耶稣会士加紧宣传天主教，将天主教捧为全世界之惟一正教，只以天主教为独尊。汤若望与当时在京的传教士利类思、安文思、南怀仁等人认真研究之后，令奉教钦天监夏官正李祖白执笔，根据明崇祯皇帝所赐“钦褒关学”匾额的“天学”二字，于康熙二年冬撰写了《天学传概》一书，三年正月，又求国子监助教许之渐为该书作序。该书刊行之后，散发给在华天主堂的传教士及有关人员。据汤若望、李祖白等人讲，此书是针对杨光先指责天主教为邪教的论点而作，以阐明天主教并非邪教，而是正教。但是，在该书中却大谈特谈许多令当时人无法理解和接受观点。譬如，在该书中写到，“天主上帝开辟乾坤，生初人男女各一。初人子孙聚居如德亚国”。其后生齿日繁，散走世界各地。“考之史册，推之历年，在中国为伏羲氏，即非伏羲，亦必先伏羲不远为中国有人之始。此中国之初人，实如德亚之苗裔”。接着又说到，中国自有初人之始，即信奉天主之教，而六经四书之类，不过是天主教的“微言法语”。自秦始皇焚书之后，天主教也在中国失传。等等。这种将中国的社会，宗教思想甚至人种完全纳入欧洲的体系，变成为欧洲的附庸和分支的理论，充分反映了欧洲中心，欧洲至上论的傲慢与偏见，导致了人们的极大反感和不信任。杨光先见到《天学传概》一书后，把它当作击败汤若望的一把利剑，于康熙三年三月二十五日，先写信给该书的作序者许之渐，指斥天主教是邪教，《天学传概》是妖书，敦促许之渐举揭汤若望，反对天主教。于七月二十六日，又写《请诛邪教状》一文，再赴礼部呈递，正式控告汤若望有三大罪状：一是潜谋造反，二是邪说惑众，三是历法荒谬。又将《天学传概》一本、《邪教图说》三本、《正国体呈》稿一本、《与许之渐书》稿一本，以及金牌，绣袋，会期等物，一并递呈礼部，要求依律将汤若望正法。清廷从三年八月初六日至四年七月，用将近一年的时间审理此案，最后作出了禁止耶稣会士在中国传播天主教的决定。并拘审捕外省传教士30余人解京。判汤若望绞刑。由于当时北京接连五天发生地震，加之“太皇太后(孝庄)力主开释”，汤若望才免于一死。清廷又恐传教士们仍然传教，收徒，建堂，也严加饬交继任各官防范。这就是康熙初发生的有名的“教案”，
康熙五年(1666年)8月15日，汤若望逝于南堂，享年75岁。康熙八年(1669年)9月，汤若望得到彻底昭雪，恢复“通玄教师”之名，1669年12月8日，康熙帝赐地重葬汤若望于利玛窦墓旁，御赐祭文一篇，镌刻在汤若望墓碑的反面，从“鞠躬尽瘁，恤死报勤，国之盛典”等用词足以见中国一代明君对这位来自万里之遥、莱茵河畔的德国传教士高度的评价和认同。
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