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二、疫情报告和诊断(2)

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建立了DNA限制性内切酶图谱分析、核酸电泳图谱分析(如鸡传染性法氏囊病病毒、呼肠孤病毒等都有特征性电泳图谱条带)、寡核苷酸指纹图、核酸探针(Northern杂交、Southerm杂交、原位杂交、斑点杂交等)、聚合醇链反应(polymerase chain reaction, PCR)以及新近几年发展起来的DNA芯片(DNAchip)技术等。

在传染病诊断方面,具有代表性的技术主要有三大类:PCR技术、核酸探针和DNA芯片技术。

(1)PCR技术:

又称为体外基因扩增技术,诞生于1985年,由美国PE-cetus公司Mullis等人发明,1987年得到美国专利局的专利授权。

它不仅在疾病诊断领域而且在整个生命科学领域都是应用最广泛、最受青睐的技术。

PCR技术用于传染病的诊断主要是检测病原核酸,不仅可以检测活的病原体,而且还可检出已灭活的病原体,甚至是存放多年的病理标本,只要病原体的核酸未降解。

因此,当由于各种原因无法进行病原分离与鉴定时(如人工方法不能培养或极端危险不宜培养),该技术将发挥巨大作用,既克服了技术难题,又安全可靠。

传染病的病原体主要有真核生物、原核生物和非细胞型生物(病毒)三大类。

每类病原体都有其特异性的核酸序列。检测出特异性核酸就能确定致病的微生物,从而确诊是哪种传染病。

PCR技术具有高度敏感性和特异性,可从10?个细胞中检出一个被病毒感染的细胞,可将同一病原的不同毒株或菌株区分开来,这是一般诊断方法难以办到的。

同时,PCR方法简便、快速,目前已广泛应用到几乎所有传染病的检测。

另外,由PCR技术与其他技术相结合又衍生出一系列相关技术,如反转录PCR(RT-PCR)、免疫PCR、抗原捕获PCR、毛细管PCR、套式PCR(Nested PCR)、重组PCR、多重PCR、荧光定量PCR等。

(2)核酸探针技术:

核酸探针又称为基因探针或核酸分子杂交技术。

该技术有三大组成部分:

待检核酸(模板),固相载体(NC硝酸纤维膜或尼龙膜),同位素、酶或荧光材料等标记的已知核酸片段(探针)。

该方法敏感性高,检测一个单基因仅需10?拷贝,能检测出低至10ˉ13g DNA,用单抗方法则至少需要10\u0027抗原分子;特异性强,可以从混合标本中正确鉴定出目的病原微生物,而且可从一个标本中同时检测几种核酸。

核酸探针诊断技术可用于所有病原体的特异诊断及分类鉴定;在混有大量杂菌或混合感染物中直接检出主要致病原,包括难以在体外培养的病原,检出隐性感染的动物,动物产品或食品的卫生检验。

但该技术由于操作复杂、耗时较长,特别是缺少商品化探针等原因,故仅用于科学研究,还从未在兽医临床诊断实践工作中应用过,因此无法与PCR技术相提并论。

(3)DNA芯片技术:

DNA芯片又称为基因芯片(gene chip)、微阵列(microarray),属于生物芯片的一种。

根据微阵列上探针不同,DNA芯片又分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片。

其技术和设备日趋成熟,在医学、遗传学等许多领域已有产品供应,例如筛选检测HIV蛋白酶基因和反转录酶基因突变的DNA芯片,某些癌症基因的诊断芯片,大肠杆菌、酵母的蛋白表达谱芯片,金黄色葡萄球菌、白色念珠菌DNA芯片等。

国外已有用于动物传染病诊断的报道,国内目前仍处于技术移植、探索和研究阶段,关键是试剂的商品化问题。

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